免疫電鏡集電子顯微技術(shù)與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)于一體，能顯示抗原或抗體在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平的位置，已成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要研究手段。由于免疫電鏡制作過(guò)程長(zhǎng)，操作程序煩鎖，因此，要得到滿(mǎn)意的免疫金染色切片，必須在關(guān)鍵環(huán)節(jié)上給予注意，以下我們就免疫電鏡染色技術(shù)中的幾個(gè)問(wèn)題進(jìn)行探討。
1、染色標(biāo)本的固定
理想的免疫電鏡標(biāo)本固定既要保存組織的抗原，又要具有良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。對(duì)于多數(shù)抗原，按常規(guī)電鏡技術(shù)固定標(biāo)本會(huì)使其抗原性部分或*消失，因此，免疫電鏡常用一些特殊的固定液，如過(guò)碘酸鹽-賴(lài)氨酸-多聚甲醛固定液(PLP)、4%多聚甲醛固定液、多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液( PG)（相關(guān)試劑：戊二醛 25%溶液）及苦味酸-多聚甲醛固定液。我們?cè)趯?shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，用1%多聚甲醛加0.01% -0.05%的戊二醛。此固定液不但配置簡(jiǎn)單，而且效果滿(mǎn)意。當(dāng)然，對(duì)于某些抗原性較強(qiáng)的標(biāo)本，也可采用4%多聚甲醛加0.05%~0.5%的戊二醛固定。有的甚至可以直接采用常規(guī)電鏡固定液固定。
2、包埋劑的選擇
被檢組織采用包埋前或包埋后方法進(jìn)行免疫染色，應(yīng)視被標(biāo)記抗原的情況而定。通常對(duì)僅檢測(cè)細(xì)胞表面的抗原選擇包埋前染色，這樣，不存在脫水、浸透及聚合對(duì)細(xì)胞抗原的破壞規(guī)包埋劑即可。相反，包埋后染色是在標(biāo)本包埋后才進(jìn)行免疫染色，對(duì)抗原常常造成較大的破壞，因此，應(yīng)根據(jù)待檢抗原的性質(zhì)選擇合適的包埋劑．以減少對(duì)抗原的破壞，提高陽(yáng)性檢出率。Epon812為zui常用的電鏡包埋劑，它要求標(biāo)本在包埋前必須*脫水，一般還需要在60℃聚合，因此，對(duì)抗原性往往有較大的破壞。我們?cè)诠ぷ髦胁捎玫蜏亻L(zhǎng)時(shí)間聚合，45℃3天，日的減少聚合反應(yīng)對(duì)抗原性保存的影響。為了減少對(duì)組織抗原性的破壞，以獲得很強(qiáng)的陽(yáng)性染色結(jié)果，不少實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用低溫包埋劑、透明合成樹(shù)脂及水溶性包埋劑（乙二醇甲酯）。通常在鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術(shù)的包埋后染色中，采用低溫包埋劑。
3、抗血清和探針
要獲得理想的免疫染色，選擇具有特異性高、親和力強(qiáng)的抗血清是實(shí)驗(yàn)成功的首要條件。一般實(shí)驗(yàn)所用的一抗都是通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)（點(diǎn)擊查看：查找抗體），購(gòu)置的一抗?jié)饪s液在使用前須用抗體稀釋液稀釋?zhuān)疚恼J(rèn)為包埋后免疫電鏡染色用的一抗?jié)舛纫哂诠忡R染色的使用濃度10~100倍。有時(shí)造成染色失敗的原因之一，就是因?yàn)榘压忡R免疫組化染色的抗體作為一抗。
探針一般用于電鏡下觀察，通常使用膠體金顯示。膠體金探針既可以通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，也可以按Slot方法自己制備。一般制備的膠體金直徑為5nm，10nm，15nm幾種規(guī)格。
4、特異性吸附問(wèn)題
免疫電鏡染色時(shí)，通常使用膠體金作為探針，然而膠體金是一種高度敏感的探針，如何克服背景，提高染色結(jié)果的特異性便成為膠體金免疫電鏡檢查的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。使用效價(jià)高、特異性強(qiáng)的一抗和活性穩(wěn)定、濃度適當(dāng)?shù)拿庖呓鹛结樢约案哔|(zhì)量稀釋度合適的抗體是克服背景污染、獲得理想標(biāo)記結(jié)果的重要條件。隨著稀釋度的增加，污染蛋白的影響會(huì)逐漸減弱。一般在檢測(cè)某種新的抗原時(shí)，須通過(guò)方陣滴定來(lái)確定一抗及金標(biāo)抗體的稀釋度。另外，還可以使用高鹽及含去污劑的緩沖液進(jìn)行洗脫，以減少背景污染，通常在緩沖液中加入氯化鈉及Triton X-100，使其濃度分別為2.5%及1%即可。當(dāng)然一抗和金探針時(shí)問(wèn)的合適，也很重要。一般時(shí)間一抗24 h(4℃)，金探針常溫2h。在實(shí)驗(yàn)中，我們常用正常羊血清(1:50-1:100)或1%牛血清白蛋白作為封閉劑，以阻斷非特異性吸附。
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